Testy DNA

Identifikace karase obecného pomocí testů DNA

V této rubrice budu zveřejňovat výsledky DNA testů karasů obecných, ke kterým mám přístup v místech, kde jsem je vysadil.

Testy DNA z odebraných vzorků jsou jediným způsobem jak na 100% zjistit zda se jedná o čistokrevnou rybu nebo o hybrida.

Na test stačí jen malý kousek prsní ploutve testované ryby. Na uchování vzorku se používá malá plastová mikrozkumavka s víčkem tzv. eppendorfka. Jako fixační roztok  je potřeba etylalkohol 96% v kvalitě vhodné pro molekulární biologii. K zakoupení v malém množství jsem ho našel u firmy Top-Bio.

Vzorky odebrané z osmi ryb jsem odeslal na adresu: Ústav biologie obratlovců AV ČR, v. v. i., DNA servis – Mgr. Jan Mendel Ph.D., Květná 8, 603 65 Brno, Česká republika. Výsledky jsem obdržel do mailu 14 dnů zpracované jako závěrečnou zprávu, která obsahovala všechny důležité informace o dodaných vzorcích. Pro každou zakázku se dělá individuální cenová nabídka.

Ke vzorkům jsem dodal informace o jejich původu, které byly také použity v závěrečné zprávě:

Doplňující informace k zaslaným vzorkům:

Vzorek 1 a 2: dosud netestovaná populace karase obecného pocházející z Poodří ze tří lokalit u města Vítkova. Bohužel lokalita v bodu 1 byla loni zlikvidována postupem skládky komunálního odpadu města Vítkova, lokalita v bodu 2 je kontaminovaná karasem stříbřitým, i když karas obecný se ještě sporadicky vyskytuje a poslední lokalita v bodě 3 je zatím nedotčená. S karasem obecným se tam ještě vyskytuje lín a perlín.

Poznámka: toto už neplatí, ulovil jsem tam i sumečka amerického. Žádná z těchto tří ryb se tam před třemi lety nevyskytovala a je pravděpodobné, že tam někdo ryby aktivně vysazuje. Je jen otázkou času kdy se tam objeví i karas stříbřitý.

Tyto ryby jsem vysadil na několik míst ve vojenském újezdu Libavá, z nichž dvě jsou poměrně dobře polohou chráněny proti úmyslné kontaminaci karasem stříbřitým.

Vzorek 3 a 4 jsou potomci ryb ze staré pískovny u Olomouce ulovené v roce 2010 a ryby byly u vás identifikačně testovány jako čistokrevní karasi obecní. Pískovna je v současnosti kontaminovaná karasem stříbřitým.  Ryby byly vysazeny do dvou jezírek na soukromém pozemku, kde se jim velice dobře daří.

Populace ale byla pravděpodobně kontaminovaná nějakým druhem závojnatky, neboť se občas vyskytne ryba s nepřirozeně vysokou hřbetní ploutví. Vzorek 5 by měl být tento hybrid.

Poznámka: jak je zřejmé ze závěrečné zprávy tak toto se neprokázalo. Pravděpodobně půjde o nějakou mutaci.

Vzorek 6 a 7 jsou potomci ryb neznámého původu zakoupených v rybářství Soboňky a ryby byly u vás identifikačně testovány jako čistokrevní karasi obecní. Zakoupeno bylo 300kusů, vysazených do tří lokalit v okolí Olomouce. Lokalita v bodu 1 v roce 2018 úplně vyschla a úspěšně rostoucí populace zanikla. Lokalita v bodu 2 zarostla a je téměř před vyschnutím. Lokalita v bodu 3 je zapomenutá umělá nádrž v lese. Bohužel krátce po vysazení karasů obecných byla kontaminovaná vyšlechtěnou bezšupinatou formou karasa stříbřitého tzv. shubunkin. Všechny tři vzorky pochází z této lokality, vzorek 6 a 7 by měli být dle vnějších znaků čistokrevní karasi obecní a vzorek 8 je pravděpodobně hybrid karasa obecného a shubunkina.

Poznámka: testem bylo potvrzeno, že se opravdu jedná o hybrida. Už ze vzhledu je poznat, že se nejedná o karasa obecného

 

Závěrečná zpráva

  

DNA servis vzorků ryb karasa obecného (Carassius carassius) – zadavatel Z. Suchý (objednávka OBJ-2020-Suchý)

Objednatel

Zdeněk Suchý, Družstevní 37, 779 00 Olomouc, Česká republika

 

Zhotovitel

Ústav biologie obratlovců AV ČR, v. v. i., DNA servis – Mgr. Jan Mendel Ph.D., Květná 8, 603 65 Brno, Česká republika

 

 

Dne 13. srpna 2020                                                             Vypracoval: Mgr. Jan Mendel, Ph.D.

1       Úvod

Objektem genetické studie byly vzorky kriticky ohroženého druhu (nový návrh ZCHD) karasa obecného (Carassius carassius), pocházející z Poodří z lokalit u Vítkova, z pískovny u Olomouce (s vysazením v lokalitě Dolany – Véska) a z rybářství Soboňky, aktuálně obývající lokality viz přiložené mapy níže. Cílem studie bylo ověření čistoty (nehybridního původu) 6 jedinců karasa obecného a průkaz 2 mezidruhových hybridů na zmiňovaných lokalitách.

 

 

Poznámka: zde byly vloženy mapy, body a souřadnice. Z důvodu ochrany těchto míst byly tyto informace odstraněny.

 

 

2       Materiál a metody

Sběr materiálu byl proveden zadavatelem. Pro účel izolace DNA byl u jedinců šetrným způsobem odebrán malý kousek prsní ploutve (cca 0,5 cm2), který byl vložen do transportního a uchovávacího media (96% ETOH). Vzorky tkání byly poštou odeslány do molekulárně-genetické laboratoře Ústavu biologie obratlovců AV ČR, v. v. i. na Květné 8 v Brně. DNA byla vyizolována komerčním kitem a PCR metodou byl namnožen jaderný marker v patentovém režimu. Pomocí genetického analyzátoru proběhla sekvenační analýza v obousměrném designu. Následně byla učiněna kontrola kvality získaných sekvencí a byl proveden identifikační a biostatistický S7iFish servis.

3       Výsledky

 3.1 Geografická situace výskytu karasa obecného na území ČR

Na základě již skončeného projektu „Inventarizace genetické diverzity ichtyofauny ČR“, který byl proveden naší vědeckou skupinou z Ústavu biologie obratlovců AV ČR, byla zjištěna zvýšená vnitrodruhová diverzita karasa obecného na našem území, jak dokumentuje Obr. 1. Byl odhalen výskyt dvou haplotypových skupin karasa, jež reflektují hydrologickou příslušnost lokalit ke dvěma úmořím. Haplotyp „A“ se vyskytuje především v oblastech úmoří Černého moře a haplotyp „B“ na lokalitách v rámci úmoří Severního moře. Obě skupiny se od sebe odlišují o 1,3 – 1,5 %. Lokality úmoří Baltu nebyly doposud podrobněji testovány.

Obr. 1. Vnitrodruhová genetická diverzita karasa obecného v ČR. Aktuální situace a výskyt dvou hlavních mt i nDNA haplotypů na lokalitách úmoří Černého a Severního moře.

 

3.2 Ověření čistoty karasa obecného a příslušnosti k hlavním nDNA haplotypům

Provedená genetická analýza 8 vzorků ukázala velkou různorodost genetických vzorů od homozygotního a vnitrodruhového heterozygotního profilu až po mezidruhového hybrida. U sedmi zkoumaných jedinců můžeme spolehlivě vyloučit existenci mezidruhových hybridů, protože sekvenační analýza prokázala výskyt jen „čistých“ k. obecných. Byli rozpoznáni 4 homozygoti s černomořským haplotypem „A“, 2 homozygoti s jaderným haplotypem „B“ hojně se vyskytující v tocích úmoří Severního moře a 1 vnitrodruhový heterozygot s oběma jadernými haplotypy „AxB“. U posledního vzorku byl jednoznačně prokázán mezidruhový hybridní původ. Konkrétněji:

Vzorek 1: karas obecný – haplotyp B

Vzorek 2: karas obecný – haplotyp B

Vzorek 3: karas obecný – haplotypy AxB – vnitrodruhový heterozygot

Vzorek 4: karas obecný – haplotyp A

Vzorek 5: karas obecný – haplotyp A

Vzorek 6: karas obecný – haplotyp A

Vzorek 7: karas obecný – haplotyp A

Vzorek 8: mezidruhový hybrid C. carassius haplotyp A x C. auratus

Maternální původ nebyl analyzován (nebyl součástí objednávky), ale je možné jej,

v případě zájmu, doplnit.

Částečné genetické profily jedinců v podobě elektroferogramů zobrazují Obr. 2 a 3.

Obr. 2. Část elektroferogramů ze sekvenačních analýz jaderného markeru S7i.

  1. homozygot C. carassius typu „A“, 2. vnitrodruhový heterozygot C. carassius typu „AxB“

Obr. 3. Část elektroferogramu ze sekvenační analýzy jaderného markeru S7i – mezidruhový hybrid C. carassius x C. auratus.

 

4  Závěr

Hlavním cílem studie bylo ověřit čistotu šesti vzorků karasa obecného a u dvou vzorků prokázat hybridní původ. Na základě provedených sekvenačních analýz lze konstatovat, že vzorky č. 1 – 7 představují čisté karasy obecné v pestřejším homozygotně – heterozygotním designu v poměru 6:1. U vzorků původem z Poodří byli zachyceni homozygoti haplotypu „B“, který je typický pro toky tekoucí do Severního moře. U ostatních vzorků šlo pak o majoritní výskyt homozygotů s černomořským haplotypem „A“ a jen jednoho heterozygota obou haplotypů AxB. Vzorek č. 8 představuje mezidruhového hybrida C. carassius x C. auratus.

Rozdílný genetický profil zjištěný na zkoumaných lokalitách je třeba zohlednit při budoucích manipulacích a zamýšlených přesunech rybí obsádky na jiné lokality.